共有34个角色可供玩家选择,其中隐藏角色不在初始列表中,未解锁时无法看到。而普通角色在未解锁前就能直接在列表中看到,部分角色甚至能直接查看解锁条件。以撒是唯一无需解锁的角色,也是绝大多数玩家第一个游玩的角色。抹大拉是当角色同时拥有7颗或更多红心时解锁,难度不高,即便遭遇逆风局,也能通过道具逐步积累。该隐是一局内中同时拥有50枚硬币即可解锁,只需多逛商店且减少不必要的消费,就能轻松达成。
犹大是任意角色击杀撒旦后解锁,属于常规流程解锁角色。夏娃是任意角色连续两层不拾取任何血量道具,包括红心、蓝心等后解锁,解锁时需注意规避各类血量道具。潘森是任意角色连续两层不受到伤害后解锁,在前两关地下室中,谨慎战斗即可获取。阿萨谢尔是在一局内与恶魔房交易3次后解锁,只需留意恶魔房刷新时机。
拉萨路需要在一局中同时拥有2个蓝心或1个黑心,伊甸是任意角色击杀妈妈的心脏1次后解锁。莉莉丝则是使用阿萨谢尔击杀贪婪模式的普通大贪婪后解锁,无需挑战究极大贪婪。亚坡伦是需要击杀超级撒旦1次后解锁,按正常流程推进即可达成。贝瑟尼则是使用拉萨路在困难模式下,不复活的情况下击杀妈妈的心脏或妈妈的腿后解锁。解锁关键是确保拉萨路全程存活,不触发复活机制。